PRACTICAL WORKSHOP 1

FLIM-FRET and new FLIM analysis strategies (« phasor »)

Place: INRA Auzeville

Speaker: Aymeric LERAY

Au cours de ce TP, nous présenterons en premier lieu le principe et l’intérêt des mesures de FRET par FLIM. Nous réaliserons ensuite des mesures de FRET dans des cellules. Nous discuterons en particulier des contrôles nécessaires (témoins positif et négatif d’interaction) afin d’éviter les artefacts classiquement rencontrés lors de mesures de FLIM.

Dans une seconde partie, nous présenterons une nouvelle méthode d’analyse d’image FLIM appelé « phasor » ou représentation polaire. Nous exposerons les avantages de cette nouvelle approche qui permet de simplifier l’analyse puisqu’elle ne fait pas intervenir de méthode d’ajustement.

PRACTICAL WORKSHOP 2

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Place: INRA Auzeville

Speakers: Cécile Pouzet, Alain jauneau FR3450, Agrobiosciences, Interactions, Biodiversity
               Christian Brière LRSV, Laboratoire Recherches Sciences Végétales
               Laurent Deslandes LIPM, Laboratoire des Interactions Plantes Microorganismes

Première Partie : Intérêt de mesurer des durées de vie de la fluorescence.
Compréhension de la chaîne instrumentale et des principaux réglages. Il pourra être discuté de la nature des sources, des fréquences et des durées de pulses, des trajets optiques et des détecteurs (le système de détection mis en œuvre, une streak camera Hamamatsu sera explicité).

Seconde Partie : Elle consistera à mesurer la durée de vie de fluorochromes et de vérifier que cette durée de vie est indépendante de la concentration. Les valeurs obtenues sur les deux postes seront comparées et discutées.
La technique de FRET en FLIM sera illustrée sur un modèle végétal : des feuilles exprimant une protéine A couplée à la CFP, et des feuilles co-exprimant A couplée à la CFP et B couplée à l’YFP. Après acquisition des images, les courbes de décroissance seront visualisées et analysées selon différents modèles.
La détermination de la durée de vie sera réalisée et les méthodes discutées.

PRACTICAL WORKSHOP 3

Luminescence (Luciférine-Luciférase)

Place: INRA Auzeville

Speakers: Aurélie Le Ru, Alain jauneau FR3450, Agrobiosciences, Interactions, Biodiversity
               Nemo Peeters LIPM, Laboratoire des Interactions Plantes Microorganismes

Première Partie : Description du banc optique en fonction des besoins formulés par les chercheurs et le fait d’utiliser des bactéries pathogènes.
Principe et fonctionnement d’une camera EMCCD en back-illuminated.

Seconde Partie : Réalisation d’images de luminescence dans le cadre d’une étude du suivi de l’infection de plante (Medicago truncatula) par des bactéries pathogènes (Ralstonia solanacearum).

PRACTICAL WORKSHOP 4

Animal cells laser capture microdissection

Place: INRA Auzeville

Speakers: Agnès Bonnet UMR 444 Génétique Cellulaire
               Yves Martinez FR3450, Agrobiosciences, Interactions, Biodiversity

Première Partie : Principe de la microdissection et discussion sur la méthodologie.
Application a une problématique scientifique : Etude de l’expression des gênes au cours de la croissance de follicules ovariens chez la brebis

Seconde Partie : Compréhension de la chaîne instrumentale et des principaux réglages (Choix des différents lasers et réglages en fonction de la problématique).
L’atelier consistera à suivre l’ensemble du processus, permettant la capture du matériel (préparation des coupes, coloration, déshydratation…)
Discussion sur les méthodes d’extraction d’ARN et sur les techniques d’analyse de l’expression des gènes.

PRACTICAL WORKSHOP 5

Automated fluorescence microscopy with multi-parameter quantitative
image analysis (HCS / HCA) (part 1)

 

Place: CHU Purpan

Speakers: Anne SION, Jean-Pierre MAQUIN Société Cellomics

Présentation générale de la technologie HCS / HCA (High Content Screening – High Content Analysis). Atelier pédagogique qui s’adresse aux personnes qui ne connaissent pas la technologie et qui souhaitent avoir une première approche de l’outil scientifique.
Il sera démontré une expérience basée sur les mesures de translocation de protéines au sein de la cellule, utilisant des facteurs de transcriptions tels que NFKB et cJUN.

PRACTICAL WORKSHOP 6

Automated fluorescence microscopy with multi-parameter quantitative image analysis (HCS / HCA) (part 2)

Place: CHU Purpan

Speakers: Anne SION, Jean-Pierre MAQUIN Société Cellomics

Présentation générale de la technologie HCS / HCA (High Content Screening – High Content Analysis). Atelier pédagogique qui s’adresse aux personnes qui veulent analyser leurs propres échantillons préparés par leur soin (nous pouvons apporter nos conseils). Les domaines en imagerie cellulaire peuvent être nombreux et il sera établi un cahier des charges et une validation technique de l’expérience en fonction de la configuration de l’ArrayScan fonctionnant au CHU de Purpan.

PRACTICAL WORKSHOP 7

FLIP by two-photon microscopy

Place: Plateau d'imagerie cellulaire du CPTP, Purpan

Speaker: Sophie Allart

Equipement : Laser femtoseconde Chameleon Ultra II sur AxioExaminer droit, 5 NDD

La technique de FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) permet de mesurer la dynamique de la mobilité, de la diffusion, du transport ou tout autre type de mouvement de molécules marquées fluorescentes dans les cellules vivantes. Elle consiste à mesurer la perte de fluorescence dans des zones environnantes au cours de blanchiments répétitifs dans un compartiment donné. L 'utilisation de la microscopie confocale est limitante pour photo-blanchir spécifiquement le compartiment nucléaire (fig.1).
Un des avantages de la microscopie bi-photonique est qu'elle procure une résolution tri-dimensionnelle de l 'excitation du fluorochrome, autrement dit une excitation confinée au point focal (Watt W. Webb, 1990). Au cours de cet atelier, nous mettrons à profit cette propriété pour étudier l 'échange entre les compartiments nucléaires et cytoplasmiques d'un virus fluorescent par FLIP (Bornavirus humain).

PRACTICAL WORKSHOP 8

Apotome, strcutured ilumination

Place: Plateau d'imagerie cellulaire du CPTP, Purpan

Speakers: Astrid Canivet, Sophie Allart

Equipement : Apotome sur AxioObserver inversé, caméra HRm

L'Apotome crée une section optique de votre échantillon fluorescent, corrigée de la lumière diffusée hors du plan focal. Grâce a l' illumination structurée, vous savez que seul le plan focal apparaît dans votre image. Le système calcule la section optique à partir de trois images, sans décalage dans le temps. Vous obtenez des images avec un contraste élevé et avec la meilleure résolution possible. L' Apotome-2 du CPTP à Purpan est monté sur microscope inversé équipé d'une source d'illumination Xcite et d'une caméra haute- résolution HRm. Apres un rapide exposé du principe, nous comparerons des acquisitions d'images faites sans(fig.1) et avec (fig.2) Apotome. puis nous verrons au cours de cet atelier que ce mode d'acquisition est particulièrement adapté i) à l imagerie de fluorescence sur coupe de tissu en mode mosaïque, ii) à l'imagerie automatisée sur plaque 6,24, ou 96 puits.

PRACTICAL WORKSHOP 9

Characterizing the diffusion of lipids by Single Particle Tracking

Place: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - IPBS / CNRS – UPS UMR 5089

Speakers: E. Haanappel, L. Salomé

Using Single Particle Tracking (SPT), we will analyze lipid diffusion in the different phases (ld, lo or so) of a supported lipid bilayer composed of a lipid mixture. In SPT, a molecule of interest (protein or lipid) is labeled with a nanoparticle, here a fluorescent polystyrene bead of ∅ 40 nm, by means of a specific antibody. Using videomicroscopy coupled to image analysis, the particle is localized with a high spatial and temporal resolution, allowing us to reconstitute precisely the trajectory of the labeled molecule. We will demonstrate the statistical tools used to determine the diffusion coefficient of the molecule under study as well as its diffusion mode (Brownian, directed or confined diffusion…).

PRACTICAL WORKSHOP 10

Conformational dynamics of single DNA molecules by Tethered Particle Motion

Place: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - IPBS / CNRS – UPS UMR 5089

Speakers: C. Tardin, L. Salomé

The Tethered Particle Motion consists in tracking the displacement of a nanoparticle tethered through a DNA molecule to a coverslip. In that way, the conformational changes in a DNA fragment can be monitored at the single molecule level. During the workshop, we will use the biochip developed in our group to run a typical parallelized TPM experiment and demonstrate the capacity of this method to analyze several hundreds of molecules simultaneously in real time. We will then show how this method can reveal DNA-protein interactions that induce modifications of the DNA mechanical properties.

PRACTICAL WORKSHOP 11

Laser induced DNA damage in cellulo: how to and what for !

Place: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - IPBS / CNRS – UPS UMR 5089

Speaker: Pierre-Olivier MARI

This mini-workshop is aimed primarily for researchers wanting to study the dynamics of DNA damage response (DDR) in living cells. Many proteins involved in any of the numerous pathways that build-up the DDR network are rapidly recruited to sites of DNA damage. Using stable cell lines expressing fluorescently tagged proteins involved in DNA repair, we will show how to locally generate high concentrations of DNA damage in living cells. We will also focus on the practical implementation, benefits and limitations of our approach and setup (multiphoton laser based). Additionally, using FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) we will present how one can investigate DNA repair kinetics at the protein level in living cells. The number of participants is limited to 4 to allow specific practical issues to be addressed (depending on the participants interests) and also because the microscope room is small. Default language: English.

PRACTICAL WORKSHOP 12

Fluorescence Recovery After Photobleaching at variable radius (FRAPvr)

Place: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - IPBS / CNRS – UPS UMR 5089

Speaker: Serge Mazères

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) is an optical technique for quantifying the lateral diffusion in model or natural membranes of lipids and proteins labeled with fluorescent probes. Most of the characterizations made on cell plasma membranes are routinely performed using confocal microscopes which, quite commonly, have a FRAP module. This FRAP imaging approach suffers from limitations, in particular a low frequency of acquisition. We will present a home-built device based on a wide-field fluorescence microscope and a PMT detector offering high acquisition rates. It is furthermore equipped with a set of field diaphragms providing uniform illumination conditions in observation areas of variable size (between 1 to 4 µm radius). We will show how performing FRAP measurements at variable spot radius permits to identify and characterize a compartmentalization of membrane receptors (Saulière – Nzeh Ndong et al J. Biol. Chem. 2010).

PRACTICAL WORKSHOP 13

Small animal imaging : whole body (part 1)

Place: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - IPBS / CNRS – UPS UMR 5089

Speaker: Golzio Muriel

The “Whole body” session will be followed by the “intravital” session by Elisabeth Bellard

In small animals, optical imaging is a low-cost technology. Wholebody imaging gives access to molecular events in cells over several weeks depending on the mouse strain (relative quantitative detection of gene expression, tumor progression …). The major limit is sensitivity and topological definition which remains associated with the turbidity of tissues. Taking into account these optical properties of living tissues, optimized conditions by selecting the probes, light source and detector suitable for fluorescence detection could be obtained. The spectral imagery was selected to eliminate autofluorescence. The studies take place on a “Leica macroscope” or devices designed specifically for wholebody imaging. It is then possible to locate the zones of expression (for example at the time of the metastatic progression) of fluorescent tumors on the animal. More accurate data are obtained by other methods (intravital microscopy) but over a more limited period of time due to the associated surgery.

PRACTICAL WORKSHOP 14

Small animal imaging : whole body (part 2)

Place: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - IPBS / CNRS – UPS UMR 5089

Speaker: Bellard Elisabeth

The “intravital” session will follow the “whole body” session by Muriel Golzio

The skin constitutes a limit in the spatial resolution. A technological improvement is to work in “intravital” mode. Surgery can give a direct vision of the target tissue or the skin can be replaced by a glass window. Detection is done on the anaesthetized animal placed on the stage of a biphotonic microscope, a wide field macroscope or a dedicated microscope with video recording. The major advantage is that the skin is not present any more in the optical path removing the phenomena of absorption, reflection and autofluorescence. The resolution on a cellular scale is accessible thanks to the multiphotonic imagery which makes it possible to resolve more in-depth emitted light signals because it uses near IR excitation wavelengths that penetrate deeply in tissues. Furthermore, the excitation is limited to a restricted volume, where the beam is focused. This technique allows to reach a depth from 200 to 600 µm. Three-dimensional images of very high-resolution are acquired. It results in elimination of out of focal plan fluorescence, less photo-degradation and photo-toxicity.

PRACTICAL WORKSHOP 15

Analysis of the viscoelastic properties of the microtubules by photoablation and time lapse videomicroscopy

Place: LBCMCP, campus UPS Rangueil

Speakers: Thomas Mangeat, Céline Reyes

Les propriétés des protéines motrices associées aux microtubules permettent de générer des forces utilisées par exemple pour le déplacement des organelles dans la cellule. L'expérience proposée permet d'annuler ces forces localement en utilisant un laser. Après une analyse par videomicroscopie nous pouvons ainsi étudier les propriétés viscoélastiques du cytosquelette de microtubules. Au cours de cet atelier, nous proposons donc d’utiliser un microscope plein champ de fluorescence couplé à la technologie de photoablation en régime picoseconde, pour l’étude des propriétés viscoélastiques du vivant, comme précédemment décrit (1, 2). Nous utiliserons des mutants de la levure S. Pombe dans lesquels les microtubules sont contraints ou non. Le but sera alors de trouver un régime de photoablation nécessaire à la dissection des microtubules sans induire de dommages excessifs à la cellule, de manière répétitive et quantitative.

(1) Ase1/Prc1-dependent spindle elongation corrects merotely during anaphase in fission yeast. Thibault Courtheoux, Guillaume Gay, Yannick Gachet, Sylvie Tournier, J Cell Biol. 2009 Nov 2; 187(3):399-412.
(2) A non-ring-like form of the Dam1 complex modulates microtubule dynamics in fission yeast. Gao Q., Courtheoux T., Gachet Y., Tournier S., and He X. PNAS, 2010 Jul 27;107(30):13330-5.

PRACTICAL WORKSHOP 16

Study of the drosophila lymphatic gland development by laser scanning microsocopy (Leica SP5 and Zeiss 710 Big)

Place: Centre de biologie du développement UMR 5547, campus UPS Rangueil

Speakers: Ismaël Morin, Brice Ronsin

L'hématopoïèse chez la drosophile se déroule au stade larvaire dans un organe appelé la glande lymphatique (GL). Cet organe est composé de 3 zones : un "Posterior Signaling Center", une zone médullaire contenant des progéniteurs hématopoïétiques et une zone corticale qui se forme au fur et à mesure que les progéniteurs se différencient en hémocytes. Il existe trois types d'hémocytes : deux d'entre eux, plasmatocytes et cellules à cristaux, se forment dans un contexte normal ; par contre le troisième type, appelé lamellocyte, ne se forme qu'après un stress tel que le parasitisme par une guêpe (Leptopilina boulardi).
Le but de l’expérience est de suivre le développement de la glande lymphatique en condition normale à faible niveau de lumière (Zeiss 710 équipé de détecteurs GaAsp), mais de pouvoir aussi observer et comparer le développement des lamellocytes lors d’un stress lié à la puissance de l’éclairage laser (Leica SP5-resonant).

PRACTICAL WORKSHOP 17

Electronic tomography

Place: LBME/IBCG, campus UPS Rangueil

Speakers: Stéphanie Balor, Franck Delavoie, Nacer Benmeradi

La tomographie électronique permet d'obtenir des images tridimensionnelles en microscopie électronique à l'échelle du nanomètre. Elle peut être appliquée à différents objets, de la molécule isolée aux coupes de tissus. Au cours de l'atelier, les modes de préparation des échantillons seront abordés (en particulier la congélation ultra-rapide), une série d'images tiltées sera réalisée sur des coupes de cellules et le volume de l'échantillon sera reconstruit à l'aide du logiciel libre IMOD.

PRACTICAL WORKSHOP 18

Multi-dimensionnal fluorescence microscopy with high temporal resolution
on living cells

Place: LBME/IBCG, campus UPS Rangueil

Speakers: O. Gadal, K. Bystricky, F. Gallardo, S. Kocanova, C. Normand

Nous étudions l’organisation nucléaire et ses changements en réponse à des stimuli externes de gènes et de leur transcrits dans les cellules humaines en temps réel. L’atelier consistera en l’observation en temps réel de mouvements intranucléaires de loci chromosomiques et d’ARN naissant rendus fluorescents par des étiquettes génétiques et le système MS2, respectivement. Nous évaluerons différentes systèmes d’acquisition, notamment différents types de cameras ANDOR.

PRACTICAL WORKSHOP 19

Quantitative phase imaging

Place: Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS 3039
            Centre Pierre Potier, 1 Place Pierre Potier, Oncopole entrée B

Speakers: Sherazade Aknoun^{1, 2}, Julien Savatier¹ (1- Institut Fresnel/équipe MOSAIC, UMR 7249, Marseille - 2- Phasics S.A., Palaiseau)

L’imagerie de phase quantitative par analyseur de front d’onde à décalage quadrilatéral permet de mesurer une différence de chemin optique (OPD, en nm) introduite par un échantillon en tout point. L’analyseur est un SID4Bio (Phasics S.A.) qui se comporte comme une caméra et ne nécessite aucune modification du microscope. On utilisera un éclairage blanc plein champ classique, avec réglage de Köhler et une sortie caméra.
Cette OPD peut être intégrée sur la surface d’une cellule en culture, après segmentation automatique, donnant accès à sa quantité de matière sèche. Cette dernière et la surface évoluant au cours du cycle cellulaire, il est possible de définir les cellules en mitose et celles proches d’y entrer (G2), après une étape de calibration. On utilisera également la possibilité de combiner cette technique avec des marquages fluorescents, de façon simultanée.

PRACTICAL WORKSHOP 20

Wavefront Sensor-based Adaptive Optics Selective-Plane Illumination Microscopy (WAOSPIM)

Place: Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS 3039
            Centre Pierre Potier, 1 Place Pierre Potier, Oncopole entrée B

Speakers: Corinne Lorenzo, Gwenaële Le Corre, Raphaël Jorand

The aim of this workshop is to show the abilities of the adaptive optics in SPIM to correct optical aberrations. Any light microscopy technique suffers from optical aberrations induce by the specimen. Those aberrations are due to variation in refractive index causing changes in the light path resulting in aberrant images. Those aberrations are more visible in thick, inhomogeneous and high scattering sample while the light path is subject to multiple variation of refractive index. Adaptive optics measures and corrects aberrations from a source point, thus restoring the optimum performance of the imaging system. Fluorescent beads are used as source point emitter. For the experiments, beads in agar and beads in agar through capillary will be used to create respectively weak and high variation of refractive index. If there is some time remaining, mutlicellular tumor spheroid with beads could be used as biological specimen.

PRACTICAL WORKSHOP 21

Atomic force microscopy for cell imaging

Place: Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS 3039
            Centre Pierre Potier, 1 Place Pierre Potier, Oncopole entrée B

Speakers: Etienne Dague, Cécile Formosa

Cet atelier pratique a pour objectif de faire découvrir et utiliser une technologie issue des sciences physiques, sur des systèmes biologiques. Il s’agit donc d’un travail à l’interface entre la biologie, la physique et la chimie. Le microscope à force atomique a été développé dans les années 80-901 suite à la découverte de l’effet tunnel2. Son utilisation en biologie est plus récente et permet des avancées dans le domaine des phénomènes intervenant à la surface des cellules3 (adhésion, reconnaissance spécifique, etc). Pour appréhender ces différents aspects, l’atelier sera basé sur l’observation de bactéries soumises ou non à un antibiotique. Nous observerons les modifications de morphologie induite par le traitement ainsi que les modifications d’élasticité des cellules.

PRACTICAL WORKSHOP 22

MultiCellular Tumor Spheroids (MCTS) imaging using light sheet illumination microscope

Place: Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS 3039
            Centre Pierre Potier, 1 Place Pierre Potier, Oncopole entrée B

Speakers: Jacques Rouquette, Céline Frongia, Annaïck Desmaison

This workshop will be dedicated to the use of SPIM to image large MCTS at a subcellular scale. Large MCTS (400µm diameter) are dense, thick and highly scaterring samples that are very challenging for conventional microscopy technologies. The light-sheet-based microscopy method known as selective plane illumination microscopy (SPIM) is well adapted to imaging large samples in 3D. In SPIM, a sheet of light illuminates the sample perpendicular to the axis of detection at the focal plane of the microscope objective, thus providing optical sectioning of the whole sample. Images are recorded with a CCD camera one plane at a time with high temporal resolution, thus limiting phototoxicity and facilitating imaging of live samples Duing this workshop, after a technical presentation of our home-made SPIM, we will do 3D acquisition of fixed MCTS produced with cells expressing a nuclear fluorescent marker (H2B-HcRed). After this demonstration of the use of SPIM, a time-lapse acquisition with dedicated sample holders will be performed.

PRACTICAL WORKSHOP 23

Multicolor TIRF : Application to architectural cytoskeleton organization

Place: Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS 3039
            Centre Pierre Potier, 1 Place Pierre Potier, Oncopole entrée B

Speakers: Jeremy Thiblet , Charles Gueudry Société Ropper Scientific

Equipement : Azimuthal TIRF microscope equipped with 405/491/561nm lasers + Dualview

Introduction to TIRF microscopy: advantages and drawbacks
Calibration of the penetration depth
Azimuthal averaging improvements
2 channel imaging of in vitro and in vivo samples

PRACTICAL WORKSHOP 24

Microfluidic devices and ultrafast sensitive microscopy for studies
of thrombus formation

Place: INSERM - I2MC (CHU Rangueil)

Speakers: Romina d’Angelo, Danièle Daviaud, Marie-Pierre Gratacap, Anne-Dominique Terrisse, Sonia Séverin

Equipement : Vidéomicroscope à haute résolution spatio-temporelle (équipé de LED et double caméra OrcaR2 et EMCCD ImageM) et Système de microfluidique Bioflux 200

Les plaquettes sanguines sont des acteurs essentiels de l'hémostase et des pathologies thrombotiques. Dans le cadre de recherche de nouvelles thérapies anti-thrombotiques nous avons mis en place des études de microfluidique pour étudier la formation du thrombus en temps réel sur différente matrices afin de se rapprocher le plus possible de la physiologie. Le système microfluidique Bioflux permet de reproduire des conditions fluidiques physiologiques, tout en permettant l'observation microscopique en temps réel. La technologie de pompe électropneumatique permet d'appliquer la même force de cisaillement dans les 24 canaux simultanément. Ce système est associé à de la videomicroscopie haute résolution spatio-temporelle (2 caméra dont une EMCCD) et un système d’acquisition rapide pour suivre en temps réel les processus de formation du thrombus qui est très rapide (film de 2-3 min).